可用於癌症的靶向治療！PP2A-Integrator-CDK9軸調控基因轉錄過程

撰文 | 章臺柳

責編 | Qi

#癌症#

基因表達的時空調控對於機體發育以及對內在和外在刺激的響應都至關重要。在大多數基因的轉錄過程中，轉錄起始後，RNAPII在轉錄60-100bp後停止，在DSIF和NELF作用下形成「暫停」構象。暫停的RNAPII仍然參與轉錄過程，只是由於移動功能的減少和結合NTP受損而無法進入延伸狀態。隨後，P-TEFb（由CDK9和cyclin T1組成）可動態磷酸化RNAPII的C端結構域（CTD）、NELF、DSIF，幫助暫停的RNAPII轉變進入活躍的延伸狀態【1】。而轉錄因子c-MYC、BRD4和SEC等可招募P-TEFb到轉錄暫停位點。

目前的研究多聚焦於RNAPII-CTD激酶，如轉錄激酶CDK7-CDK9和CDK11-CDK13，對於靶向RNAPII-CTD的磷酸酶則研究較少。近期發現一組磷酸酶可在哺乳動物和較低生物體內去磷酸化RNAPII-CTD，對於RNAPII的迴圈非常重要。例如，CDK9可介導DSIF組分SPT5的磷酸化，而PP1和PP4分別在DSIF從轉錄延伸向轉錄終止和啟動子附近區域對SPT5進行去磷酸化【2-3】。這說明激酶和磷酸酶之間具有功能上的相互作用，從而動態調控核心轉錄機器。CDK9的小分子抑制劑可抑制轉錄延伸，導致低磷酸化的RNAPII在轉錄暫停位點聚集，抑制轉錄過程。癌症中轉錄過程發生失調，CDK9抑制劑可用於癌症治療。那麼，激酶和磷酸酶之間的互作是否會影響CDK9抑制劑的抗腫瘤功能？

2021年5月17日，來自澳大利亞Peter MacCallum癌症中心的Ricky W. Johnstone 和美國威斯塔研究所的Alessandro Gardini合作在Cell雜誌上發表題為The PP2A-Integrator-CDK9 axis fine-tunes transcription and can be targeted therapeutically in cancer的文章，發現PP2A複合物通過整合子複合物亞基INTS6招募到轉錄位點，PP2A動態拮抗CDK9對其底物——DSIF和RNAPII-CTD的磷酸化，在功能上抵抗CDK9介導的RNAPII驅動的轉錄過程。敲除整合子組分INTS6可抑制CDK9i誘導的腫瘤細胞死亡，誘導轉錄延伸，以及急性致癌轉錄反應的擴增。藥物啟用PP2A可協同CDK9抑制劑殺死白血病和實體瘤細胞，提高體內的治療效果。

為了探索拮抗CDK9激酶活性的分子，研究人員利用CRISPR技術對CDK9抑制劑（CDK9i）處理的腫瘤細胞進行篩選，檢測指標有長期的細胞生存狀態和nascent RNA轉錄水平。綜合分析後發現，靶向整合子複合物亞基INTS6導致細胞對CDK9i具有耐藥性。敲除INTS6顯著提高CDK9i處理細胞的生長競爭優勢，減少CDK9i誘導的凋亡，這種現象在多種腫瘤細胞和果蠅細胞系中得到驗證，同時研究顯示這種現象與整合子複合物的破壞、脫靶效應或其他CDK的活性等無關。探究INTS6/整合子的相互作用蛋白，發現INTS6與其他13種整合子複合物成員、RNAPII核心亞基、PP2A磷酸酶複合物亞基PPP2R1A/PPP2R1B和PP2A-C/PPP2CB具有相互作用。敲低INTS6或INTS8導致PP2A-C和整合子複合物、RNAPII的互作降低，而敲低INTS5或INTS12則不影響。缺失INTS6或INTS8並不影響整合子複合物的催化活性或結構完整性。即INTS6和INTS8是整合子複合物的一部分，可介導PP2A的招募，而這在結構和功能上都不同於整合子INTS4/9/11的催化功能。

那麼PP2A被招募到哪裡？PP2A、BRD4、RNAPII、CDK9、INTS6、INTS11都位於轉錄起始點（TSS）區域；CDK9i處理導致RNAPII、BRD4、INTS11在TSS區域累積，而INTS6則略微減少。LPS和EGF急性刺激下，RNAPII、RRR2R1A在TSS和基因主體上招募增加，同時伴隨著轉錄的增加。敲除INTS6或INTS8則導致PPP2R1A結合減少，PPP2R1A和PP2A-C的蛋白水平不變。即PP2A與P-TEFb、整合子在基因組上共定位，其動態的招募依賴於INTS6和INTS8。分析蛋白磷酸化水平，發現CDK9i導致多種蛋白磷酸化水平發生改變，而INTS6缺失導致這些蛋白對CDK9i產生耐藥，包括重要的CDK9底物SPT5、RNAPII-CTD、LEO1等。體外系統證明，CDK9和RNAPII-CTD的孵育導致CTD的高磷酸化，而新增PP2A顯著減少CTD的磷酸化水平。同時底物的出現導致CDK9激酶活性增加，CDK9抑制劑可抑制CDK9激酶活性，而新增PP2A不影響；CDK9磷酸化的CTD可被PP2A去磷酸化，說明PP2A直接作用於CTD。暫停係數是衡量RNAPII暫停程度的指標，計算分析發現無論是靜息狀態，還是急性刺激誘導轉錄狀態，CDK9i處理導致轉錄減少，暫停的釋放過程受阻，而敲除INTS6/PP2A則增加RNAPII在基因主體和轉錄結束位點的分佈，減少RNAPII在TSS的積累，即緩解了CDK9i誘導的轉錄延伸阻斷。因此，在急性刺激條件（如EGF和LPS）下，INTS6或PPP2R1A的缺失導致RNAPII在相應基因的基因主體和3’端顯著增加，基因表達增加。

最後，研究人員發現PP2A啟用劑和CDK9抑制劑聯用可顯著增加CDK9i誘導的細胞死亡，而缺失INTS6則協同作用消失。這種協同作用在轉錄水平表現為RNAPII暫停的增加，而PP2A啟用劑單獨對RNAPII暫停作用較小。白血病和實體瘤小鼠模型中，兩者聯用顯著抑制腫瘤生長，延長小鼠生存期。

總的來說，研究發現整合子亞基INTS6、INTS8和磷酸酶PP2A形成一個調節模組，其功能和結構都與整合子複合物不同，被招募到活躍轉錄的基因上中和CDK9的活性，從而控制CDK9底物RNAPII-CTD、DSIF的磷酸化水平，調控基因轉錄。同時CDK9抑制劑和PP2A啟用劑聯用顯著增強CDK9i的抗腫瘤活性，或提供了一種新的腫瘤治療思路。

值得一提的是，2020年11月27日，復旦大學生物醫學研究院徐彥輝課題組和陳飛課題組合作在Science雜誌線上發表題為Identification of Integrator-PP2A complex (INTAC), an RNA Polymerase II phosphatase的研究長文（ 專家點評｜轉錄調控複合物INTAC結構功能更新對磷酸酶PP2A的認知），發現了一個全新的轉錄調控複合物 INTAC（16個亞基，分子量近1.5MDa），解析了INTAC的高分辨冷凍電鏡結構，揭示了INTAC作為一個雙功能酶，同時具備RNA剪下和去磷酸化活性，可去除Pol II的多個CTD磷酸化位點發揮轉錄抑制功能。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.022

參考文獻

1. Core, L., and Adelman, K. (2019). Promoter-proximal pausing of RNA polymer- ase II: a nexus of gene regulation. Genes Dev.33, 960–982.

2. Parua, P.K., Booth, G.T., Sanso , M., Benjamin, B., Tanny, J.C., Lis, J.T., and Fisher, R.P. (2018). A Cdk9-PP1 switch regulates the elongation-termination transition of RNA polymerase II. Nature558, 460–464.

3. Parua, P.K., Kalan, S., Benjamin, B., Sanso , M., and Fisher, R.P. (2020). Distinct Cdk9-phosphatase switches act at the beginning and end of elonga- tion by RNA polymerase II. Nat. Commun.11, 4338.